纪伟^1,2,3 , 高兆建² , 柴文波¹ , 潘秋红³ , 李春如³ , 赵海泉^1*

1 安徽农业大学生命科学院, 合肥, 230036; 2 徐州工程学院, 徐州, 221000; 3 浙江泛亚生物医药股份有限公司, 平湖, 314200
作者    通讯作者
《分子植物育种》印刷版, 2018 年, 第 16 卷, 第 18 篇   
收稿日期: 2018年03月08日    接受日期: 2018年03月30日    发表日期: 2019年01月17日

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现阶段野生菌株生产琼胶酶还存在诸多问题，如产酶量低、易污染、生长慢等缺点，不利于工业化大规模生产。通过分子生物学手段合成的一段弧菌琼胶酶基因 agav-2，对其进行重组表达。本研究将弧菌琼胶酶基因 agav-2 插入原核表达载体 pET30a(+)中，并转入大肠杆菌 BL21(DE3)，构建重组表达载体 pET-30a(+)-agav-2，对构建的重组子进行诱导表达，利用 DNS 法测定琼胶酶酶活，对诱导条件和表达的琼胶酶酶学性质进行探究。成功构建重组表达载体 pET30a(+)-agav-2，在异丙基 -茁-D- 硫代半乳糖苷(IPTG)诱导后，测定酶活 58.60 U/mL，通过十二烷基硫酸钠－聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)可知表达的琼胶酶分子量为51.5 kD。诱导条件研究表明最佳诱导温度为 30℃，最佳诱导时间为 9 h，最佳 IPTG 终浓度为 0.7 mmol/L。酶理化性质实验表明该琼胶酶最适温度为 45℃，最适 pH 值为 9.0，Ca2+ 对酶具有显著的激活作用，Mg2+、Fe3+、NH4+、K+、Na+、Mn2+、Fe2+、Ba2+、Cu2+、Ag+ 对琼胶酶的活力没有显著影响，而 Pb2+ 对琼胶酶的活性有显著抑制作用。酶的稳定性实验显示，100℃处理 30 min 仍有一定的活性，对 pH 的适用范围也比较大。构建的重组表达载体 pET30a(+)-agav-2，不仅具有很好的工业化生产潜力，同时考虑到琼胶酶对琼脂水解作用而呈现肉眼可见的凹陷状，重组表达载体 pET30a(+)-agav-2 可作为功能基因筛选的标记工具。

琼胶酶；原核表达；诱导条件优化；酶学性质